Las células llevan transfectadas 48 horas, por lo que ya han podido expresar nuestra proteína de interés, pudiendo así ver su fluorescencia en microscopía de confocal, para lo que hay que preparar las células. Retiramos el medio de cultivo y lavamos las células con PBS, luego añadimos PFA para fijar las células y conservar su …
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LAB: Día 5
Hoy hemos seleccionado las mejores construcciones para transfectarlas con las células. Las transfectamos con PEI y después le pusimos optiMEM. Las agitamos y añadimos un micro gramo de ADN. Después gorreamos las mezclas y las dejamos reposar 20 minutos. Añadimos la mezcla a los pocillos con las células mediante pipeteo por goteo. Después empleamos las …
LAB: Día 4
Las colonias que sembramos en el medio se han multiplicado, multiplicando así nuestros plásmidos. Utilizamos un kit para extraer y purificar el plásmido de las bacterias. Medimos el rendimiento de la extracción utilizando el nanodrop. Después hicimos una mezcla que dividimos en 7 tubos, y a cada uno le añadimos el ADN de una colonia …
LAB: Día 3
En el día de hoy, introducimos la proteína BK que hemos construido introduciendo la proteína fosforescente en líneas celulares; que para este caso, utilizamos la H3K293T, que son células epiteliales embrionarias de riñón. Para ello, lo primero que hicimos fue aspirar el medio de cultivo de DMEM High Glucose y añadimos 5ml de PBS1x estéril …
LAB: Día 2
Hoy hemos purificado los fragmentos de ADN que habíamos puesto en la nevera con un kit, Macherey Nagel específico para esto, y hemos medido la concentración del ADN utilizando el nanodrop. Después procedimos a hacer unos cálculos para la nueva mezcla de los ADN con otras substancias, añadiendo encimas para que se producirse la ligación …
LAB: Día 1
A un plásmido de la proteína BK le hemos añadido una serie de encimas (AscI) y otras sustancias para crear dos mezclas, una de ellas será el vector, y la otra el fragmento que le introduciremos. Después las hemos dejado digerir durante 1H a 37ºC. Mientras se digería, creamos una gelatina con agarosa, TAE y …
Dr. Asclepio 